一年生pair扮演者

孤雌生殖

2006年，Nature杂志发表的一篇文章轰动了学术界，这篇文章证实科莫多巨蜥可以通过孤雌生殖（Parthenogenesis）繁衍后代，动物园仅有的两只雌性科莫多巨蜥在长期未接触雄性科莫多巨蜥的情况下，生了蛋并孵化出了小宝宝，基因检测显示小宝宝的基因完全来自于它们的母亲 (Watts et al., 2006)。

恐怖的科莫多巨蜥

恐怖的科莫多巨蜥

图1 科莫多巨蜥以及通过孤雌生殖出生的小巨蜥。科莫多巨蜥是世界上最大的蜥蜴，体长可达3米，体重可达70千克。在此之前发现了七十多种可以进行孤雌生殖的脊椎动物但大部分体型较小。2006年，英国伦敦动物园的Sungai和切斯特动物园的Flora被报道通过孤雌生殖的方式产下了小巨蜥，小巨蜥全部为雄性，这与科莫多巨蜥的ZW性别决定机制有关，同时，小巨蜥是正常的二倍体生物噢。

孤雌生殖：指雌性配子可以在没有雄性配子的情况下单独发育成胚胎，它是无性繁殖的一种自然形式，是生物的一种生殖策略。它发生在一些植物、无脊椎动物（例如轮虫、线虫、水蚤、蚜虫、螨虫、蚂蚁、蜜蜂等）和脊椎动物（例如鱼、两栖动物、爬行动物、鸟等）中。

图2 有性生殖和孤雌生殖的过程。有性生殖（红色部分）是由卵母细胞和精母细胞分别形成配子，结合后形成受精卵，再由受精卵发育成为新个体的生殖方式。而孤雌生殖没有形成受精卵这一步，它分为单倍体孤雌生殖（紫色部分）、自体融合生殖（橙色部分）和无融合生殖（黄色部分）这几种类型。图片来源：Britannica。

那么有哪些孤雌生殖的方式呢？

（1）一些生物的卵母细胞通过减数分裂形成配子，配子直接发育成个体，这种方式称之为单倍体孤雌生殖（Haploid parthenogenesis）（图2）。典型例子为蜜蜂群中蜂后的生产方式，蜂后产的未受精卵发育成雄蜂，雄蜂即为单倍体配子发育而成；蜂后产的受精卵发育成工蜂，为有性生殖。

（2）在开篇科莫多巨蜥的例子中，雌性科莫多巨蜥的卵子与它的一个“姐妹”——极体融合，这种雌性配子之间自行融合并发育出胚胎的孤雌生殖被称为自体融合生殖（Automixis）（图2）。

注：卵母细胞经过两次减数分裂会形成一个卵细胞和2-3个极体，极体一般会自行凋亡，但在特殊情况下，会存活下来。

（3）一些生物的卵母细胞不通过减数分裂形成配子，而是通过有丝分裂形成配子，那么配子生来就是二倍体，并由此发育出个体，这种生殖方式叫无融合生殖（Apomixis）（图2）。这种生殖方式也将是伯小远本文将重点和大家分享的。

图3 有丝分裂（mitosis）和减数分裂（meiosis）过程图。图片来源：http://bio1151b.nicerweb.net。有丝分裂经一次分裂，一个母细胞形成两个与母细胞完全相同的二倍体子细胞；减数分裂则经过两次分裂，一个母细胞形成四个与母细胞完全不同的单倍体性细胞。

杂种优势

杂种优势（Heterosis）是指两个遗传组成不同的亲本（物种、亚种、品种或自交系）杂交，产生的杂种F1代在生长势、繁殖力、抗逆性、产量及品质等方面比其双亲表现优越的现象。几乎所有一年生作物都在一定程度上表现出杂种优势。

图4 玉米不同表型性状杂种优势的表现 (Hochholdinger & Baldauf, 2018)。杂种优势的表型体现在（A）玉米幼苗根的性状、（B）株高和（C）穗轴大小。

在生产上可利用这个特点进行生产，但一般只能利用F1代，F2代由于基因重组导致性状分离，在生产上无法继续使用。因此，每年都必须制备具有杂种优势的F1代种子供生产使用。

那么，如何进行杂种一代制种呢？目前有以下几种方法：

01人工去雄生产杂交种子

如烟草、番茄。难度大，成本较高。

02利用化学药剂杀雄

不同植株的生殖器官发育并非完全同步，加之气候因素造成的不确定性均会对化学杀雄效果产生影响。

03利用自交不亲和系

如大白菜、甘蓝等多采用这种方法。品种（或品系）有正常的雌蕊和雄蕊，但自交和兄妹交（兄妹交是指品种或品系不同植株间授粉）均基本不结实的育种材料，就是自交不亲和系。以这种品系做母本，以普通品种做父本，间行种植，收获的就是杂种一代种子。

04利用雄性不育系

如高粱、水稻。利用雄性器官退化或异常但雌性器官发育正常的株系免去人工去雄的麻烦，下面将进行介绍。

大家听的最多的可能是利用雄性不育系（“三系法”）生产杂交水稻的方法，该体系的发明人是“杂交水稻之父”——袁隆平院士。水稻是典型的自花授粉植物，雌雄同花（图5），水稻的杂种优势可以利用雄性不育株系，通过异花授粉的方式来生产杂种一代种子。

图5 水稻花的结构。

“三系”是指雄性不育系（A）、雄性不育保持系（B）和雄性不育恢复系（R）（图6）。“三系法”是指保持系与不育系杂交，获得不育系种子供来年制种和繁殖用；不育系和恢复系杂交，获得杂交种子；保持系与恢复系的自交种子则继续作为保持系和恢复系使用。

1973年，石明松先生发现了光敏不育系农垦58S，它是由核基因控制的雄性不育系，育性转换受光温条件影响，既可以自身繁种，又可以作为不育系用于制种。后来在袁隆平院士的主持下，“两系法”杂交水稻研究成功并投入应用。

图6 三系法（a）和两系法（b）杂交水稻工艺对比图 (He, 2020)。

无融合生殖

1987年，袁隆平院士在《杂交水稻》杂志上发表了《杂交水稻的育种战略设想》一文，提出了杂交水稻的育种可以分为三系法、两系法和一系法三个战略发展阶段，朝着程序上由繁到简且效率越来越高的方向发展。三系法和两系法，伯小远已经介绍过了，那袁爷爷说的一系法是什么呢？其实一系法指的就是利用无融合生殖技术固定杂种优势的育种方法。早在上世纪30年代，国外科学家们就提出了利用无融合生殖的方式固定杂种优势的设想。但经过多国科学家近一个世纪的攻关，仍然未研究清楚其分子机制，也未能按设想那般将该技术应用于作物育种中。但最近十几年的研究成果，正在使这种困境逐渐好转。

AMAZING 惊！减数分裂逆转为有丝分裂！

按照我们在前文“孤雌生殖”部分所述——“一些生物的卵母细胞不通过减数分裂形成配子，而是通过有丝分裂形成配子，那么配子生来就是二倍体，并由此发育出个体，这种生殖方式叫无融合生殖”，那么在植物中，如果我们想通过无融合生殖技术来进行杂种一代制种，那么，我们需要让植物的母细胞绕过正常的减数分裂和双受精（图7）过程，绕过孟德尔和摩尔根提出的遗传学三大定律，才有实现的可能。也就是说，想要得到和母本一模一样的克隆种子，目前的重点在于如何将母细胞的减数分裂过程转变为有丝分裂？

图7 植物减数分裂和双受精过程。图片来源：Adobe Stock。

2009年，法国国家农业研究院Raphaël Mercier团队在Plos biology杂志上发表了题为“Turning meiosis into mitosis”的文章 (d'Erfurth et al., 2009)，该团队创造性地开发出了一种拥有MiMe基因型的拟南芥，其母细胞的减数分裂被有丝分裂完全取代，因此可产生二倍体配子（图8），该研究是工程化无融合生殖技术的重要一步。

图8 该文主要结果的示意图 (d'Erfurth et al., 2009)。第一次减数分裂时，同源染色体重组并分离，第二次减数分裂过程更类似于有丝分裂，最终姐妹染色单体均匀分离。在osd1突变体中，第二次减数分裂被跳过，因而产生了具有重组遗传信息的二倍体配子。Atspo11-1/Atrec8双突变体经历类似有丝分裂的分裂，而不是正常的第一次减数分裂，之后是不均匀的第二次减数分裂，而这种不平衡的染色体分离最终导致不育。在osd1/Atspo11-1/Atrec8三突变体（MiMe基因型）中，Atspo11-1/Atrec8突变的存在导致类似有丝分裂的第一次减数分裂发生，而osd1突变的存在阻止了第二次减数分裂的发生，至此，减数分裂被有丝分裂取代。因此，拥有MiMe基因型的植株，其配子在基因上与母细胞相同。MiMe（mitosis instead of meiosis）指有丝分裂代替减数分裂。

在osd1/Atspo11-1/Atrec8三突变体（MiMe基因型）中，母细胞的减数分裂终于如期望般地被有丝分裂取代了，看起来离实现无融合生殖似乎很近了，但问题又来了，由于母细胞不再进行减数分裂，那MiMe的子代岂不是每繁殖一代就会增加一倍的染色体数量？事实也确实如此（图9）。

图9 MiMe株系的每一代都会倍性加倍 (d'Erfurth et al., 2009)。在随后的的几代中，MiMe的倍性在每一代翻倍，从（A）2n（10条染色体）到（B）4n（20条染色体）到（C）8n（40条染色体），左侧显示有丝分裂中期，右侧显示相应的4周龄植物和花朵。

综上，想要实现无融合生殖，已经成功了第一步，即让母细胞进行有丝分裂而非减数分裂，那么接下来，还需要进行第二步。

AMAZING惊！让有丝分裂刹车！

2011年，Raphaël Mercier团队再接再厉，与Imran Siddiqi团队和Simon W L Chan团队合作，在Science杂志上发表了题为“Synthetic clonal reproduction through seeds”的文章 (Marimuthu et al., 2011)，他们将上文中提到的MiMe株系的子代与GEM株系杂交，得到了与母本相同的克隆种子（图10B、C）。

伯小远猜想，Raphaël Mercier团队大概是受2010年发表的Nature文章“Haploid plants produced by centromere-mediated genome elimination”的启发，这篇文章在“纯系养成——单倍体诱导技术（二）”中有详细解读，重点在于一个有关CENH3（着丝粒组蛋白3）的材料可以作为单倍体诱导系，而这可能可以阻止MiMe株系的每一代都会倍性加倍的特性。

GEM株系是指将两种经修饰的CENH3共转拟南芥cenh3-1胚致死突变体，可恢复植株的野生表型，将其作为父本，与母本MiMe株系杂交，后代中来自父本的染色体会消亡，结果显示后代中34%（53/155）的个体为二倍体，而98%的二倍体子代仅含来自母本的染色体。

图10 该文主要结果的示意图 (Marimuthu et al., 2011)。（A）在天然的无融合生殖过程中，种子未受精即可发育。为了从有性植物中诱导克隆种子，该团队使用了一个经杂交后子代的部分染色体会消亡的材料GEM；（B、C）将MiMe或dyad突变体与GEM杂交后，对子代基因型的检测。

虽然该研究还未达到仅通过自交即可获得克隆种子的预想，但该研究为在作物中实现无融合生殖的路径提供了一种重要思路。研究到这里，那么接下来要解决如何通过自交获得克隆种子的问题！

2019年，中国农科院王克剑团队和Raphaël Mercier团队在Nature Biotechnology杂志上发表了题为“Clonal seeds from hybrid rice by simultaneous genome engineering of meiosis and fertilization genes”的文章 (Wang et al., 2019)，该研究将杂交水稻中三个减数分裂关键基因REC8、PAIR1及OSD1和参与受精的MTL基因共四个内源基因进行基因编辑，得到了Fix基因型植株，自交后其后代中存在二倍体子代，实现了杂种一代杂种优势的固定，无需额外的杂交就可以直接获得克隆种子。

注：关于水稻REC8、PAIR1及OSD1基因的相关背景知识可参考Raphaël Mercier团队的论文 (Mieulet et al., 2016)；关于水稻MTL基因的相关背景知识可参考文章“纯系养成——单倍体诱导技术（一）”。

图11 在杂交水稻CY84中进行多重基因编辑固定水稻杂种优势 (Wang et al., 2019)。（a）固定杂种优势的理论模型；（b）同时靶向REC8、PAIR1及OSD1和MTL的CRISPR/Cas9载体；（c）比较在田中生长的CY84和Fix（osd1 pair1 rec8 mtl）的植物形态，Fix的结实率较低（4.5%），败育的种子用白色箭头表示，正常发育的种子用红色箭头表示；（d）用流式细胞仪对Fix的后代进行倍性分析，其后代包括四倍体和二倍体；（e）Fix的四倍体和二倍体后代及Fix克隆子代的后代的全基因组测序；（f）比较在田中生长的CY84和Fix克隆子代的植物形态，败育的种子用白色箭头表示，正常发育的种子用红色箭头表示。

该研究基于前期的研究成果，通过敲除四个基因创制Fix材料以获得克隆种子：敲除三个与减数分裂有关的基因REC8、PAIR1及OSD1，将杂交水稻CY84母细胞的减数分裂转变为有丝分裂，同时，敲除与受精有关的MTL基因使其后代倍性不变。首次实现了杂交水稻一系法的理论验证。可以预见，无融合生殖的下一步将是解决结实率低以及后代中二倍体占比低（6%=9/145）的问题。

AMAZING 惊！还有其他实现路径！

2019年，Venkatesan Sundaresan团队在Nature杂志上发表了题为“A male-expressed rice embryogenic trigger redirected for asexual propagation through seeds”的文章 (Khanday et al., 2019)，研究表明，在卵细胞中异位表达BBM1就足以诱导孤雌生殖；在MiMe材料中表达BBM1基因可以诱导产生克隆种子。这说明在有性繁殖植物中可以通过基因设计来实现无性繁殖，并可将这种方法扩展到大多数谷类作物中。

图12 水稻无性繁殖 (Khanday et al., 2019)。（a）使用CRISPR/Cas9载体创制MiMe材料；过表达BBM1基因创制BBM1-ee材料；（b）流式细胞仪检测MiMe材料T1子代的4n倍性；（c）左侧：MiMe T0二倍体子代，中间：MiMe T1四倍体子代，右侧：S-Apo材料（MiMe与BBM1-ee的子代）；（d）野生型材料和S-Apo材料的花药；（e）野生型材料、二倍体子代、四倍体子代的稻穗比较；（f、g）各材料的种子大小比较。

小远叨叨

在本文中，伯小远给大家介绍了孤雌生殖、杂种优势，还带大家复习了有丝分裂、减数分裂、双受精等基础知识，最后给大家分享了在植物无融合生殖方向重要的研究成果。

大家可以看到，想在一个领域取得好的成果，需要创新且专注，每一个成果都是在前期研究的基础上不断迭代更新。把一个复杂的问题层层拆解，一个一个、一点一点地来进行解决，同时关注与研究领域相关的最新成果，大胆合作，再利用合适的研究工具，相信最后的结果一定会如愿以偿！

最后，伯小远也希望大家一起努力，做一粒好种子！早日实现袁爷爷心心念念的一系法杂交水稻的生产！

References：

Qiang He, Huafeng Deng, Pingyong Sun, Wuhan Zhang, Fu Shu, Junjie Xing, Zhirong Peng, 2020. Hybrid Rice. Engineering 6, 967-973.

D'erfurth I, Jolivet S, Froger N, Catrice O, Novatchkova M, Mercier R, 2009. Turning meiosis into mitosis. PLoS Biol 7, e1000124.

Hochholdinger F, Baldauf JA, 2018. Heterosis in plants. Curr Biol 28, R1089-R92.

Khanday I, Skinner D, Yang B, Mercier R, Sundaresan V, 2019. A male-expressed rice embryogenic trigger redirected for asexual propagation through seeds. Nature 565, 91-5.

Marimuthu MP, Jolivet S, Ravi M, et al., 2011. Synthetic clonal reproduction through seeds. Science 331, 876.

Mieulet D, Jolivet S, Rivard M, et al., 2016. Turning rice meiosis into mitosis. Cell Res 26, 1242-54.

Wang C, Liu Q, Shen Y, et al., 2019. Clonal seeds from hybrid rice by simultaneous genome engineering of meiosis and fertilization genes. Nat Biotechnol 37, 283-6.

Watts PC, Buley KR, Sanderson S, Boardman W, Ciofi C, Gibson R, 2006. Parthenogenesis in Komodo dragons. Nature 444, 1021-2.

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